Analisi OGM: metodi e problematiche

Sistemi analalitici per l'identificazione degli OGM

Dott. Rossana Amari - www.biogenlab.it - Biogenlab s.r.l.

L’impiego di Organismi Geneticamente Modificati in agricoltura rappresenta l’aspetto più controverso nelle loro applicazioni poiché prevede l’utilizzo di semi, di piante o di frutti che sono direttamente implicati nelle produzioni alimentari.

Le problematiche principali riguardano almeno due aspetti:

1) considerazioni ambientali (disseminazione di OGM, effetti su piante e animali, ecc.);

2) considerazioni relative alla salute umana (effetti tossici o allergenici, ecc.)

A seguito di un’attenta valutazione delle problematiche connesse con l’impiego di OGM è stato proposto di attenersi al "Principio di precauzione" secondo cui "se esiste la possibilità di danni seri e irreversibili, le azioni di prevenzione sono giustificate anche in assenza di prove scientifiche del danno".

La commercializzazione degli stessi generi alimentari contenenti ingredienti ottenuti da organismi geneticamente modificati è stata sottoposta a normative per tutelare il consumatore, tali normative impongono l’identificazione precisa del prodotto impiegato tramite etichettatura.

NORMATIVA EUROPEA

A seguito della diffusione di OGM sono state emanate norme comunitarie e nazionali aventi lo scopo di disciplinare la produzione e la commercializzazione di tali organismi.

Si redige un elenco di tutti gli alimenti OGM (pomodoro TGT7F, cicoria, radicchi rossi, soia RR, mais GA21, mais BT11, mais BT176, mais T25X MON 810, barbabietola da zucchero, olio di colza e semi di colza, patata New Leaf, ecc).

Sancisce il divieto di utilizzare materie prime transgeniche per la produzione di alimenti destinati a lattanti e bambini.

Stabilisce che tutti i prodotti derivanti da soia e mais ottenuti mediante l’impiego di OGM devono essere etichettati come prodotti transgenici.

Gli additivi o aromi GM o provenienti da OGM devono essere soggetti ad etichettatura se superano la soglia dell1% per ogni singolo ingrediente.

Riporta tutta la procedura necessaria per l’autorizzazione ad emettere nell’ambiente OGM sia a scopo di ricerca e sviluppo che a scopo commerciale.

METODICHE ANALITICHE

L’esigenza di adeguarsi a norme Europee implica l’esistenza di metodologie analitiche in grado di rilevare la presenza di componenti transgeniche negli alimenti.

I metodi di riconoscimento di materiale proveniente da piante transgeniche negli alimenti si sono affinati negli ultimi anni per essere in grado di combattere le frodi e le sofisticazioni alimentari.

Si possono inglobare i diversi metodi in tre grandi categorie:

 

ricercano direttamente il gene modificato nel DNA, si applica una tecnica analitica chiamata "PCR (Polymerase Chain Reaction)" ossia reazione a catena della polimerasi che risulta estremamente specifica e sensibile, consentendo di individuare anche percentuali molto basse di contaminazioni nelle derrate alimentari;

 

ricercano le proteine codificate dal transgene preso in considerazione, si eseguono impiegando test immunologici ELISA che si avvalgono di anticorpi diretti contro le proteine codificate dal transgene, oppure metodi che analizzano il contenuto proteico mediante spettrometria di massa (ESI-MS e MALDI-TOF);

 

considerano il metabolita codificato dal transgene o il peptide e utilizzano tecniche combinate di cromatografia liquida "on-line" con spettrometria di massa a sistemi di ionizzazione elettrospray (HPLC-ESI-MS e MALDI-TOF).

PCR (REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI)

Le fasi principali di questa tecnica sono le seguenti:

 

denaturazione = i due filamenti di DNA del materiale genetico estratto e purificato si devono separare per consentire ai primers di appaiarsi nel punto corretto, a questo scopo la T deve essere elevata (95C)

5’------------------------3’

5’------------------------3’

3’------------------------5’ 95C Þ

3’------------------------5’

annealing = i primers devono riconoscere il target specifico nei filamenti di DNA resi accessibili dalla denaturazione, questo riconoscimento si verifica ad una T inferiore (50-60C) rispetto a quella di denaturazione così il ciclizzatore termico abbassa la temperatura ma i due filamenti non si riappaiano perché la concentrazione di primers è superiore a quella dei due filamenti di DNA.

 

5’-----------------------------3’

___5’ primer1

 

5’___ primer2

3’------------------------------5’

sintesi o estensione = La Taq DNA Polimerasi, vicino al primer, deve polimerizzare il filamento di DNA specifico inserendo al posto giusto i nucleotidi necessari, deve duplicare il tratto di DNA per un n di volte che viene impostato nel termociclatore di volta in volta dal personale tecnico a seconda del tipo di indagine da eseguire, solitamente si prevedono circa 40 cicli.

5’--------------------------------3’

3’------------------- Ô___5’primer1

Polimerasi

­

DNTP’s (A G C T)

¯

Polimerasi

5’___ Ô-----------------3’

3’--------------------------------5’

 

Il filamento originario 5’---® 3’ risulta così identico al filamento duplicato su quello originario 3’--® 5’ mentre quello duplicato sul filamento originario 5’---® 3’ risulta identico a quello originario 3’---® 5’.

 

In seguito all’amplificazione del tratto di DNA specifico occorre visualizzare il risultato tramite l’allestimento di un gel per elettroforesi.

L’elettroforesi consiste nella migrazione di molecole cariche sottoposte ad un campo elettrico: in questo caso le molecole cariche sono rappresentate dai frammenti di DNA amplificati in modo specifico con la PCR (in particolare dai gruppi fosfato, elementi costitutivi del DNA) che, a seconda delle loro diverse lunghezze e quindi del loro peso molecolare, migrano a velocità differenti se sottoposti a un campo elettrico.

Trascorso il tempo necessario affinchè i frammenti di materiale genetico migrino a determinate condizioni ottimali di voltaggio e corrente, si giunge all’ultima fase dell’analisi con PCR in cui si visualizzano le bande migrate nel gel di agarosio grazie ad un transluminatore.

Si confrontano tra di loro le varie bande con uno standard di basi per riconoscere quelle eventualmente transgeniche o di particolare interesse.

NESTED PCR

Consiste in due PCR successive, nella prima si amplifica un segmento abbastanza ampio di DNA (di alcune centinaia di paia di basi) e nella seconda si amplifica un segmento più ridotto situato all’interno al primo e ottenuto dalla prima amplificazione.

 

PCR QUANTITATIVA-COMPETITIVA

Utilizza un competitore interno (DNA standard) il più vicino possibile alla dimensione e alla sequenza nucleotidica del target (DNA bersaglio), entrambi sono amplificati e separati tramite corsa elettroforetica che evidenzia due bande distinte. La quantificazione si ottiene dal confronto delle dimensioni tra la banda del target e quella del competitore.

REAL TIME PCR

Questa tecnica è la più sofisticata e offre il vantaggio di conoscere la quantità di DNA che viene amplificata ad ogni istante grazie all’impiego di un oligonucleotide sonda, marcato con due molecole fluorescenti, che si lega al DNA target. Poiché la sonda è degradata dall’attività nucleasica della Polimerasi i due fluorofori si separano rendendo possibile la rilevazione dell’emissione di uno solo dei due. La fluorescenza accumulata nel campione è proporzionale alla quantità di DNA amplificato.

Questa tecnica molto sensibile riesce a rilevare la presenza di percentuali molto basse di DNA.

MICROARRAY

Si utilizza questo metodo per verificare antifraudolenza, si impiegano simultaneamente diverse sonde molecolari, oligonucleotidi o polinucleotidi, consentendo così il rilevamento di molteplici caratteristiche molecolari di un campione di DNA. Risulta utile soprattutto quando un alimento risulta costituito da diverse specie di OGM.

PROBLEMATICHE ANALITICHE

Non bisogna pensare che non esistano problematiche da risolvere nell’esecuzione di queste analisi, la rappresentatività del campione, la estrazione di DNA di buona qualità, la quantificazione del transgene, la validazione delle metodiche analitiche sono alcuni degli aspetti ancora da approfondire.

La rappresentatività della campionatura sta alla base di tutta l’analisi per questa ragione occorre effettuare il prelievo in modo accurato, cercando di campionare diversi punti del prodotto allo scopo di omogenizzarlo, infatti il quantitativo di campione che verrà sottoposto all’analisi con PCR è veramente esiguo e non consente di individuare in modo dettagliato eventuali contaminazioni.

Altre problematiche tipiche delle analisi con PCR riguardano sia l’efficienza estrattiva del materiale genetico, si valuta questo passaggio servendosi di metodi spettrofotometrici, sia il grado di purezza del DNA, lo si valuta misurando il rapporto dei valori di assorbimento ottenuti a A260/A280 .

Infine occorre assicurarsi dell’assenza nel DNA da introdurre nel termociclatore di inibitori della PCR, per valutare ciò si utilizzano per l’amplificazione dei primers specifici per un frammento genico universale, presente in tutte le specie vegetali e che devono quindi essere visualizzati nell’ultima fase dell’analisi.

Per quanto riguarda la validazione dei metodi analitici, in Italia non esiste una metodica convalidata, si utilizzano procedimenti avvalorati dai risultati Europei, o dalla partecipazione di ring-test nazionali ed internazionali.

 

IL FUTURO DEGLI OGM

Prescindendo da valutazioni critiche in un senso o nell’altro è necessario fare il punto della situazione sugli alimenti OGM poiché si possono trovare sulle tavole ed entrare conseguentemente nel ciclo della nostra alimentazione. Non è semplice chiarire le perplessità causate dall’introduzione sul mercato di alimenti transgenici soprattutto per due ragioni:

lo stato attuale delle conoscenze e la complessità dell’argomento non consentono di rispondere in modo certo a tutte le domande, soprattutto a quelle riguardanti le conseguenze sulla nostra salute in seguito ad ingestione di alimenti transgenici, infatti gli effetti potrebbero essere cumulativi ed evidenti dopo parecchio tempo dall’ingestione, tra i quali è stato ipotizzato:

la selezione di insetti resistenti ai caratteri inseriti nella pianta transgenica, soprattutto se il gene trasferito proviene da un batterio che produce una proteina con effetto letale nei confronti di insetti parassiti dei vegetali;

la maggior resistenza a trattamenti chimici quali impiego di pesticidi o erbicidi indotta in seguito all’inserimento di un gene può portare ad un maggior utilizzo di questi prodotti dannosi per la salute dell’uomo;

la selezione di ibridi ottenuta dalla diffusione, grazie al trasporto del polline delle piante transgeniche, del carattere modificato a piante della stessa specie o di specie affini non modificate;

la diminuzione della biodiversità degli organismi in seguito al massiccio utilizzo di pochi tipi di semi transgenici uguali in tutto il mondo, con la conseguente scomparsa di specie esistenti attualmente.

I controlli eseguiti a livello di prodotti non riescono a risolvere da soli il problema della diffusione di materiale derivato da OGM, occorre a questo scopo un controllo a monte sulle materie prime e sui processi produttivi.

Sarebbe opportuno che i produttori e i commercianti facessero della qualità il proprio strumento di azione economica, certificando l’origine controllata degli ingredienti, in modo da garantire al consumatore la tracciabilità dei prodotti.

Ogni categoria dovrebbe attenersi a determinate regole: i produttori dovrebbero rispettare le norme vigenti senza nessuna eccezione, il commerciante dovrebbe assicurare al compratore la qualità della merce fornendo i certificati relativi ed eseguendo prelievi a campione da sottoporre ad analisi, il consumatore infine dovrebbe poter scegliere liberamente cosa acquistare, dopo aver ricevuto una dimostrazione efficace e veritiera da parte degli organi competenti che gli OGM sono sicuri per l’ambiente e soprattutto per la salute dei consumatori, in grado di fornire benefici non solo al produttore bensì anche al consumatore.

 

ID 58, ut 1, pubblicato il 20/11/2002